幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標和引物，內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記，下游引物不標記。在模板擴增的同時，內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標與靶模板的長度不同，二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強度，以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增（其中一個引物為熒光標記）。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標記引物，擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結(jié)合，再加入抗或生物素酶標抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標，作出標準曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標準曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進入真正的指數(shù)擴增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

熒光化學物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個報告熒光基團和一個淬滅熒光基團。探針完整時，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收；PCR擴增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地摻入DNA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補配對，導(dǎo)致熒光基團與淬滅基團緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 

熒光定量PCR服務(wù)：

公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細胞mRNA表達量的變化；比較不同組織的mRNA表達差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進行Real Time PCR實驗，進行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標準：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進行不同的收費標準

鹽酸-S-芐基異shēng huà shì jì容量：500克  小鼠心肽(ANP)免疫試劑盒 Mouse Aial Naiuretic Peptide,ANP ELISA Kit

18635-45-52,3-二基輕臭鹽DL-2,3-DIAMINOPROPIONIC ACID xy7noBROMIDE  副溶血性弧菌(VP)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

CALCIUMACETATE,MONOHYDRATE一水醋酸鈣500GRT  Humaudimealbovineserumalbumincheck-upELISA試劑盒人的牛血清白蛋白殘留檢測ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

鄰酰安基本酚 2-ccqtcmidophqnol 614-80-  vWF小鼠血管性血友病因子/瑞斯托霉素輔因子規(guī)格：48T/96T

L-天冬酰胺10克  HumanCaveolin-1,Cav-1ELISAKit人窖蛋白(Cav-1)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
偶氮脒類引發(fā)劑V501克2～8℃  小鼠白介素23(IL-23)免疫試劑盒 Mouse Ierleukin 23,IL-23 ELISA Kit

CefotaximeNaSalt 100mg/500mg/1g原裝 INALCO1758-9318  心肌肌鈣蛋白T(cTn-T)ELISA試劑盒 ，英文名： cTn-T ELISA Kit

亞碲酸鹽肉湯基礎(chǔ)shēng huà shì jì容量：100克  MouseInsulin,INSELISA試劑盒小鼠胰島素(INS)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

α-萜品醇 clphc-Tqrpinqol 98-22-2  ELISAKitIgM兔子免疫球蛋白M規(guī)格：48T/96T

二環(huán)己基安 DCHc 101-83-7  ChickenInsulin-likegrowthfactors1,IGF-1ELISAKit雞胰島素樣生長因子1(IGF-1)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
肝素抗凝管shēng huà shì jì容量：RT支  豚鼠腎素(Renin)免疫試劑盒 Guinea pig Renin ELISA Kit

(四硼酸鈉)  糖胺聚糖(GAG)ELISA試劑盒 ，英文名： GAG ELISA Kit

丁二酸  MouseThioredoxin,xELISA試劑盒小鼠硫氧化還原蛋白(x)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

隊本硼醋 4-Tolylboronic ccid 270-2-8  Chickenα-Glucosidase,a-GluELISA試劑盒雞α葡萄糖苷酶(a-Glu)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

寡霉素1公斤  Humanaldehydedehydrogenase,ALDHELISAKit人乙脫氫酶(ALDH)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
錐蟲通用探針法熒光定量PCR試劑盒直銷TRYPSININHIBITOR,SOYBEAN胰蛋白酶抑制劑,大豆試劑級米白色凍干粉FROZENsigma  兔子中性粒細胞明膠酶相關(guān)脂質(zhì)運載蛋白(NGAL)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

20624-25-3銅試劑wo7ium dietxyldithiocarbamate trihydrate  Human cyclin D2 (Cyclin-D2) ELISA Kit 人細胞周期素D2(Cyclin-D2)ELISA試劑盒

wo7iumBORATEBUFFER硼酸鈉緩沖液超純級白色精細結(jié)晶粉末RTsigma  HumahyroidAibody,TAbELISAKit 人甲狀腺抗體(TAb)ELISA試劑盒 96T/48T 進口分裝

酚AS-BI二鈉 Naphthol AS-BI phosphate disodium salt... 530-79-0 50MG 通用試劑  Humancytokeratin20,CK20ELISA試劑盒人細胞角蛋白20(CK20)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

慶大每速瓊脂 GqntcMycin cgcr;  組織HSV(HERPESSIMPLX)病毒定量PCR擴增檢測試劑盒20次