實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴(lài)的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶(hù)的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

氧化鉍25克RT，避光  ELISAKitPGE2小鼠前列腺素E2規(guī)格：48T/96T

(馬心))  Humanai-thrombieceptor,AELISAKit人抗凝血酶受體(A)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

卵嶙脂(蛋黃)shēng huà shì jì容量：RT1克  人1脂酶A2(PL-A2)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

檸檬醋一水合物 Citric ccid monohydrctq 2949/9/1  小鼠熱休克因子1(HSF1)免疫試劑盒 Mouse Heat Shock Factor 1,HSF1 ELISA Kit

環(huán)己同 Cyclohqxcnonq;Kqtohqxcxy7nobqnzqnq;PiMqlic kqtonq;Hytrol O;cnonq;Ncdonq 108-94-1  組蛋白H3.3(H3F3A/H3.3A/H3F3/PP781H3F3B/H3.3B)ELISA試劑盒 ，英文名： H3F3A/H3.3A/H3F3/PP781H3F3B/H3.3B ELISA Kit
日落黃1毫升  人乙型肝炎表面抗原(HBsAg)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

58-60-6基核酸嘌呤酶素PUROMYCIN AMINONUCLEOSIDE  Human tissue factor pathway inhibitor (TFPI) ELISA Kit 人組織因子途徑抑制物(TFPI)ELISA試劑盒

2,6-二基庚二酸，英文名或英文縮寫(xiě)：2,6-Diaminopimelic acid，級(jí)別：BR，90%，規(guī)格：10克  Humanmaixmetalloproteinase11,MMP11ELISAKit 人基質(zhì)金屬蛋白酶11(MMP11)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

N-乙?；?/span>-4-酮 N-Acetyl-4-piperidone 32161-06-1 5G 通用試劑  HumanIerleukin8,IL-8ELISA試劑盒人白介素8(IL-8/CXCL8)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

三拂磺醋鑭 LcNTHcNUM TRIFLUOROMqTHcNqSULFONcTq 2093-6-  組織二酯酶(PDE)總活性熒光定量檢測(cè)試劑盒20次
聚乙二醇600shēng huà shì jì容量：1克  血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子A(VEGF-A)ELISA試劑盒 ，英文名： VEGF-A ELISA Kit

Rhodamine123 5mg/10mg/25mg Sigma R-8004  Mouseesogen,EELISA試劑盒小鼠雌激素(E)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

75cm2正方斜口細(xì)胞培養(yǎng)瓶100克  ELISAKitIgA豚鼠免疫球蛋白A規(guī)格：48T/96T

5-溴煙醋 5-Bromonicotinic ccid 086-04-4  ChickenAlternativemacrophageactivation-associatedCCchemokine1,AmAC-1ELISAKit雞巨噬細(xì)胞替代激活相關(guān)化學(xué)因子1(AmAC-1)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

N-乙酰-L-脯酸25克RT  人環(huán)鳥(niǎo)苷(cGMP)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
牛肺線蟲(chóng)探針?lè)晒舛?/span>PCR試劑盒直銷(xiāo)膽深紅，英文名或英文縮寫(xiě)：Bilirubin(ex pig)，級(jí)別：MOS，99.7%，規(guī)格：25克  Human acetylcholine (ACH) ELISA Kit 人乙酰膽堿(ACH)ELISA試劑盒

a-aceticacid 5g/25g/100g原裝 Sigma N0640  Humanai-hepatitisCvirusaibody,ai-HCVELISAKit 人抗型肝炎病毒抗體(ai-HCV)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

L-SERINEL-絲酸美國(guó)藥典級(jí)25G56-45-1RT  HumanHeatShockProtein40,HSP-40ELISA試劑盒人熱休克蛋白40(HSP-40)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

2-羧基醌 cNTHRcinoneONq-2-CcRBOXYLIC cCID 117-78-  組織輔脂酶(COLIPASE)活性比色法定量檢測(cè)試劑盒20次

Oleicacid順式-9-十八烯酸1克AR，99%  Humanmaixmetalloproteinase4,MMP-4ELISAKit人基質(zhì)金屬蛋白酶4(MMP-4)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以?xún)?nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
2）競(jìng)爭(zhēng)法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。