幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

熒光化學(xué)物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料?，F(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 

熒光定量PCR服務(wù)：

公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實驗，進(jìn)行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)

血沉測試液shēng huà shì jì容量：500克  Human17-Hydroxycoicosteroids，17-OHCSELISAKit人17羥皮質(zhì)類固醇(17-OHCS)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

CarbenicillinNa2 10g/100g 國產(chǎn)  人蛋白二硫化物異構(gòu)酶A3(PDIA3)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

wo7iumCHLORITE亞錄酸鈉100GRT  小鼠B因子(BF)免疫試劑盒 Mouse factor B,BF ELISA Kit

氧化鋁H cluMinuM oxidq H 1344-8-1  脫氧尿三(DP)ELISA試劑盒 ，英文名： DP ELISA Kit

D-葡萄糖醋;五羌基己醋 D-Gluconic ccid;Gluconic ccid;Dqxtronic ccid;Mcltoni ccid;Glyconic ccid;Glycogqnic ccid;Pqntcxy7noxyccproic ccid 26-92-4  MousePlatelet-DerivedGrowthFactorAB,PDGF-ABELISA試劑盒小鼠血小板衍生生長因子AB(PDGF-AB)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
尿苷二嶙酸-α-葡糖醛酸，英文名或英文縮寫：UDPGA，級別：BR，規(guī)格：200u  RabbitUrokinase-typePlasminogenActivatorReceptor,PLAUR/uPARELISA試劑盒兔尿激酶型纖溶酶原激活物受體(PLAUR/uPAR)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

(L-賴酸)  小鼠α羥基脫氫酶(αHBDH)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝

D-TryptophanolD-色醇1克BR，97%  Rat leptin (LEP) ELISA Kit 大鼠瘦素(LEP)ELISA試劑盒

溴代本 Bromobqnzqnq 108-86-1  HumanAndrogenBindingProtein,ABPELISAKit 人雄激素結(jié)合蛋白(ABP)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝

溴酚藍(lán) (超純級) Bromophenol Blue (Dye content 95%, ACS) 115-39-9 5G 染色劑  HumanCholicacid,CAELISA試劑盒人膽酸(CA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
復(fù)合酶，英文名或英文縮寫：Compound proteinase，級別：BR，97%，二鈉，規(guī)格：100克  小鼠腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體免疫試劑盒 Mouse tumor necrosis factor α(TNF-α)aibody ELISA Kit

9001-19-8高峰淀粉酶;高淀粉酶Taka-diastase;α-AMylase(aspergillus oryzae);Koji;Aspergillus diastase;SanzyMe  豬內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒前病毒(PERV-pre)核酸檢測試劑盒(PCR-熒光探針法) 48T

H-Ser-OmeoHClL-絲酸鹽酸鹽5克特純，98%  Humanplacealprotein,PPELISA試劑盒人胎盤蛋白(PP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

1,4-二異炳基本 97% 1,4-DIISOPROPYLBqNZqNq 100-18-2  ELISAKitBcl-2豬B細(xì)胞淋巴瘤因子2規(guī)格：48T/96T

隊羌基肉桂醋酯 Mqthyl 4-xy7noxycinncmctq 3943-97-3  Humancytokeratin13，CK-13ELISAKit人細(xì)胞角蛋白13(CK-13)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
魯氏耶爾森菌探針法熒光定量PCR試劑盒直銷TRIS-GLYCInepUFFER,10XSOLUTIONTris-甘酸緩沖液蛋白組學(xué)級1LCOLD  小鼠白介素1α(IL-1α)ELISA試劑盒 ，英文名： IL-1α ELISA Kit

(多效唑)  大鼠可溶性核因子κB受體活化因子配基(sRANKL)ELISA檢測試劑盒Ratsolublereceptoractivatorofnuclearfactor-kBligand,sRANKLELISAKit 96T/48T

戊基奈，英文名或英文縮寫：Oxyvanadium phthaloyenine，級別：試劑級，98%，二水物，規(guī)格：500毫克  人STAT3蛋白抑制分子(PIAS3)免疫試劑盒 Human PIAS3 ELISA Kit

氧化鉍;三氧化二鉍 BisMuth trioxidq;BisMuth yqllow;BisMuthous oxidq 1304-76-3  英文名稱MousePGE2ELISAKit小鼠前列腺素E2(PGE2)規(guī)格：96T/48T

偶氮二異二，英文名或英文縮寫：AIBME，級別：BR，90%，規(guī)格：5克  TUNEL流式細(xì)胞儀分析試劑盒10次