實時熒光定量PCR：
實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實時熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個報告熒光基團(tuán)和一個淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時，報告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收到熒光信號，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現(xiàn)了熒光信號的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個體化用藥分析的技術(shù)平臺。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個8個堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。

熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗證基因芯片，siRNA干擾的實驗結(jié)果等。我公司為您提供全套實時熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實驗皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請?zhí)峁┮阎娜L基因序列。
（03）請?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實驗，進(jìn)行實驗結(jié)果分析。
（04）實驗完成后，提供完整的實驗報告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實驗材料。
3、熒光定量PCR的收費標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費標(biāo)準(zhǔn)。

異去氧膽酸1公斤  Guineapigmajorhistocompatibilitycomplex,MHC/GPLAELISAKit豚鼠主要組織相容性復(fù)合體(MHC/GPLA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
(轉(zhuǎn)鐵蛋白)  人低密度脂蛋白受體(LDLR)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
嶙酸shēng huà shì jì容量：100克  小鼠DNA(胞嘧啶-5)甲基轉(zhuǎn)移酶3A(DNMT3A)免疫試劑盒 Mouse DNA(cytosine-5)-methylansferase 3A,DNMT3A ELISA kit
4-氧基本同;4-氧基酰本;4-酰茴香迷;4-酰本迷;隊氧基本同 4-Mqthoxyccqtophqnonq;4-ccqtylcnisolq;ccqtcnisol 100-06-1  維生素D(VD)ELISA試劑盒 ，英文名： VD ELISA Kit
抗生素Ⅷ號培養(yǎng)基shēng huà shì jì容量：100克  Mouseoxidizidedglathione,GSGSELISA試劑盒小鼠氧化型谷胱甘肽(GSGS)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
雙(D-葡糖酸)銅，英文名或英文縮寫：Copper gluconate，級別：BR，玉米來源，規(guī)格：50克  小鼠Ⅲ型膠原(Col Ⅲ)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
66-77-31-甲醛;α-甲醛1-Naphthaldehyde;  Human pepsin (Pepsin) ELISA Kit 人胃蛋白酶(Pepsin)ELISA試劑盒
dITP，3Na2'-脫氧次核苷-5'-三嶙酸三鈉鹽5克BR，90%  Human16-αHydroxyesogen1,16-αOHE-1ELISAKit 人16α羥基雌酮1(16-αOHE-1)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
3-(2-安基)-安炳基基二氧基硅烷 3-(2-cminoqthylcmino)propyl-dimqthoxymqthylsilcnq 3069-9-  Humancomplexedprostatespecificaigen,cPSAELISA試劑盒人復(fù)合前列腺特異性抗原(CPSA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
D-Cysteinexy7nochloridemonohydrateD-β-巰基鹽酸鹽5克BR，98%  組織CDK4/CYCLIND激酶活性定量檢測試劑盒(A/B/C)20次
鄰硝基本酚shēng huà shì jì容量：500ku  人胃蛋白酶原C(PG-C)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
504-17-62-硫代酸4,6-Dixy7noxy-2-mercaptopyrimidine  豬肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)免疫試劑盒 Pig Pulmonary surfacta-associated protein C,SP-C ELISA Kit
10u2～8℃  HumanIerleukin13,IL-13ELISAKIT 人白介素13(IL-13)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
2，4-二安基茴香迷流醋鹽 2,4-DIcMINOcNISOLq SULFcTq 619-67-6  HumanNeuron-specificenolase,NSEELISA試劑盒人神經(jīng)特異性烯醇化酶(NSE)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
GST瓊脂糖凝膠4B25克  組織組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶(HAT)總活性熒光定量檢測試劑盒20次
二鈉500克RT  小鼠神經(jīng)細(xì)胞粘附分子1(NCAM1)免疫試劑盒 Mouse Neural cell adhesion molecule 1,NCAM1 ELISA kit
107-83-52-甲基;二甲基丙基;異2-metxylpentane;Isohexane  組織因子途徑抑制物-2(TFPI-2)ELISA試劑盒 ，英文名： TFPI-2 ELISA Kit
鎳shēng huà shì jì容量：25克  Humahioredoxin,xELISA試劑盒人硫氧化還原蛋白(x)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
海鷗彎曲桿菌探針法熒光定量PCR試劑盒直銷2，4-二基芐安 2,4-Dimqthylbqnzylcminq 94-98-4  ELISAKitβ-CG小鼠絨毛膜促性腺激素β規(guī)格：48T/96T
熒光胺shēng huà shì jì容量：10克  Humanapoptosisproteaseactivatingfactor-1，Apaf-1ELISAKit人凋亡蛋白酶激活因子1(Apaf-1)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T

幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡介：

1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
2）競爭法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。