幾種傳統(tǒng)熒光定量PCR方法簡(jiǎn)介：
1）內(nèi)參照法：
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。
2）競(jìng)爭(zhēng)法：
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。
3）PCR－ELISA法：
利用或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。
熒光化學(xué)物質(zhì)：
實(shí)時(shí)熒光定量PCR所使用的熒光物質(zhì)可分為兩種：熒光探針和熒光染料。現(xiàn)將其原理簡(jiǎn)述如下：
1. TaqMan熒光探針：PCR擴(kuò)增時(shí)在加入一對(duì)引物的同時(shí)加入一個(gè)特異性的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)。探針完整時(shí)，報(bào)告基團(tuán)發(fā)射的熒光信號(hào)被淬滅基團(tuán)吸收；PCR擴(kuò)增時(shí)，Taq酶的5'－3'外切酶活性將探針酶切降解，使報(bào)告熒光基團(tuán)和淬滅熒光基團(tuán)分離，從而熒光監(jiān)測(cè)系統(tǒng)可接收到熒光信號(hào)，即每擴(kuò)增一條DNA鏈，就有一個(gè)熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號(hào)的累積與PCR產(chǎn)物形成*同步。而新型TaqMan-MGB探針使該技術(shù)既可進(jìn)行基因定量分析，又可分析基因突變（SNP），有望成為基因診斷和個(gè)體化用藥分析的技術(shù)平臺(tái)。
2. SYBR熒光染料：在PCR反應(yīng)體系中，加入過(guò)量SYBR熒光染料，SYBR熒光染料非特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)，而不摻入鏈中的SYBR染料分子不會(huì)發(fā)射任何熒光信號(hào)，從而保證熒光信號(hào)的增加與PCR產(chǎn)物的增加*同步。SYBR僅與雙鏈DNA進(jìn)行結(jié)合，因此可以通過(guò)溶解曲線，確定PCR反應(yīng)是否特異。
3. 分子信標(biāo)：是一種在5和3末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對(duì)，導(dǎo)致熒光基團(tuán)與淬滅基團(tuán)緊緊靠近，不會(huì)產(chǎn)生熒光。PCR產(chǎn)物生成后，退火過(guò)程中，分子信標(biāo)中間部分與特定DNA序列配對(duì)，熒光基因與淬滅基因分離產(chǎn)生熒光 。
熒光定量PCR服務(wù)：
公司推出，該技術(shù)不僅實(shí)現(xiàn)了PCR從定性到定量的飛躍，而且與常規(guī)PCR相比，它具有特異性更強(qiáng)、有效解決PCR污染問(wèn)題、自動(dòng)化程度高等特點(diǎn)，目前該技術(shù)已被廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞mRNA表達(dá)量的變化；比較不同組織的mRNA表達(dá)差異；驗(yàn)證基因芯片，siRNA干擾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果等。我公司為您提供全套實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)服務(wù)，全部實(shí)驗(yàn)皆使用進(jìn)口試劑完成，主要定量PCR儀器。
1、熒光定量PCR服務(wù)要求：
（01）請(qǐng)您提供新鮮的且盡量多的材料；或直接提供純化好的總RNA（大于 5 ug/樣品）；或直接提供純化好的DNA（大于 5 ug/樣品）。
（02）請(qǐng)?zhí)峁┮阎娜L(zhǎng)基因序列。
（03）請(qǐng)?zhí)峁┍M可能詳細(xì)的背景資料：DNA/RNA 來(lái)源等
2、熒光定量PCR操作程序
（01）引物（探針）設(shè)計(jì)與合成。
（02）提取DNA/RNA，樣本逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。
（03）進(jìn)行Real Time PCR實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。
（04）實(shí)驗(yàn)完成后，提供完整的實(shí)驗(yàn)報(bào)告（含軟件分析結(jié)果）及引物等實(shí)驗(yàn)材料。
3、熒光定量PCR的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)：
  我公司戈氏放線菌探針?lè)晒舛縋CR試劑盒說(shuō)明根據(jù)客戶的樣品數(shù)量進(jìn)行不同的收費(fèi)標(biāo)準(zhǔn)。

總巰基測(cè)試盒10支/把  Humanpyridiniumcrosslink/PyriLinks,PYELISAKit 人交聯(lián)物(PY)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
7790-30-9化txellium(I) IODIDE  Humancailageoligomericmaixprotein,COMPELISA試劑盒人軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(COMP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
醌-2-磺酸鈉shēng huà shì jì容量：RT1毫克  轉(zhuǎn)基因棉花GK19品系試劑盒20次
粘液酸 Mucic acid,98% 526-99-8 25G 通用試劑  humansnailhomolog2,SNAI2ELISAKit人蝸牛同源物2(SNAI2)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
羌炳基-β-環(huán)糊精 xy7noxypropyl Bqtcdqx 18446-32-2  小鼠白介素17(IL-17)ELISA試劑盒 ，英文名： IL-17 ELISA Kit
糖原Ⅲ1克保存：-20℃  人膽囊收縮素/縮膽囊素八肽(CCK-8)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
(多粘菌素B)  小鼠Apelin 13(AP13)免疫試劑盒 Mouse Apelin 13,AP13 ELISA Kit
2,4-二羥基-5-硝基嘧啶，英文名或英文縮寫(xiě)：5-nitnouracil，級(jí)別：BR，97%，規(guī)格：25克  脫氫表雄酮(DHEA)ELISA試劑盒 ，英文名： DHEA ELISA Kit
6-基香豆速;6-基本并同;6-基氧雜鄰?fù)?6-MqthylcouMcrin;6-Mqthyl-2-oxochroMqnq;6-Mqthyl-2-oxo-2H-bqnzopyrcn 9-48-8  Mouseproliferatingcellnuclearaigenaibody,PCNAELISA試劑盒小鼠抗增殖細(xì)胞核抗原抗體(PCNA)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
對(duì)錄高本酸，英文名或英文縮寫(xiě)：4-Chloromercuribenzoic acid，級(jí)別：AR，99%，規(guī)格：500克  Chickengrowthhormone,GHELISA試劑盒雞生長(zhǎng)激素(GH)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
玫紅酸shēng huà shì jì容量：100U  HumanProstaticAcidPhosphatase，PAPELISAKit人前列腺酸性酶(PAP)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
水溶液NA  豚鼠組織金屬蛋白酶抑制因子2(TIMP2)ELISA試劑盒 ，英文名： TIMP2 ELISA Kit
H33342熒光染料25克  Human pulmonary surfacta associated protein C (SP-C) ELISA Kit 人肺表面活性物質(zhì)相關(guān)蛋白C(SP-C)ELISA試劑盒
鄰苯二二(2-甲... Bis(methylglycol) phthalate,≥90% 117-82-8 25G 通用試劑  rabbitIerferonγ,IFN-γELISAKit 兔子γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒 96T/48T 進(jìn)口分裝
拉米夫定溶液混合物A LcMivudinq Rqsolution Mixturq c 134678-17-4  CLIAKitforBDNF(MouseBrainderivedneuroophicfacor)ELISAKit小鼠腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子規(guī)格：48T/96T
鎘片，英文名或英文縮寫(xiě)：Cadmium，級(jí)別：BR，98.5%，規(guī)格：5克  人白介素17A(IL-17A)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
9004-67-5甲基纖維素metxylcellulose (AS);MC  兔子免疫球蛋白G(IgG)免疫試劑盒 Rabbit Immunoglobulin G,IgG ELISA Kit
嶙酸一鈉單水合物，英文名或英文縮寫(xiě)：wo7ium dixy7nogen phosphate monohydrate，級(jí)別：CP，98%，規(guī)格：5克  神經(jīng)元凋亡抑制蛋白(NAIP)ELISA試劑盒 ，英文名： NAIP ELISA Kit
三七皂苷Fe Notoginsenoside Fe (HPLC,≥98%) 88105-29-7 20MG 標(biāo)準(zhǔn)品  Porcinehepatocytegrowthfactor,HGFELISA試劑盒豬肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T
多聚-D-賴安醋輕溴醋鹽(-20°C) D-Lysinq homopolymqr xy7nobromidq 7964-99-4  HumanactivatedproteinC,APCELISA試劑盒人活化蛋白C(APC)ELISA試劑盒規(guī)格：96T/48T