深入了解ELISA法測定抗體效價的原理 一 實驗原理 ELISA是以免疫學反應(yīng)為基礎(chǔ)，將抗原、抗體的特異性反應(yīng)與酶對底物的催化作用相結(jié)合起來的一種敏感性很高的試驗技術(shù)。免疫酶技術(shù)是將酶標記在抗體/抗原分子上，形成酶標抗體/酶標抗原，稱為酶結(jié)合物。該酶結(jié)合物的酶在免疫反 應(yīng)后，作用于底物使之呈色，根據(jù)顏色的有無和深淺，定位或定量抗原/抗體。ELISA 法是免疫酶技術(shù)的一種，其特點是利用聚苯乙烯微量反應(yīng)板(或球)吸附抗原/抗體，使之固相化，免疫反應(yīng)和酶促反應(yīng)都在其中進行。在每次反應(yīng)后都要反復洗 滌，這既保證了反應(yīng)的定量關(guān)系，也避免了末反應(yīng)的游離抗體/抗原的分離步驟。在ELISA 法中。酶促反應(yīng)只進行一次，而 抗原、抗體的免疫反應(yīng)可進行一次或數(shù)次，即可用二抗(抗抗體)、三抗再次進行免疫反應(yīng)。 二 操作步驟 ①抗原包被：兔抗人IgG 作為抗原，用包被液l：8000稀釋，100μL/孔加入聚苯乙烯96孔反應(yīng)板中。4℃放置過夜。 ②洗滌：次日傾去凹孔內(nèi)的液體，洗滌液洗3次。 ③封閉：加l00μL/孔封閉液，室溫放置0.5h. ④洗滌：用洗滌液洗3次。 ⑤加待測樣品(一抗)：將含單克降抗體的細胞培養(yǎng)上清在另-塊板上用PBS 連續(xù)稀釋(按照1：2或1：10)，100μL /孔加到 已包被的板上，每個樣品平行做兩份，PBS 或空白培養(yǎng)基作為陰性對照，已知樣品作為陽性對照。加蓋37℃恒溫箱溫育 1~2h。 ⑥洗滌：用洗滌液洗3次。 ⑦加酶標抗抗體：兔抗鼠IgG-HRP，用封閉液l ：8000稀釋，100μL／孔，加蓋37℃恒溫箱溫育1h。 ⑧洗滌：用洗滌液洗5次，蒸餾水洗2次。 ⑨顯色：加新鮮配制的底物溶液100μL/孔，室溫暗處放置5～30min，顯示藍色。 ⑩終止反應(yīng)、比色：加50μL/孔終止液。顏色變黃；用酶標儀測定450nm 處各孔的吸光值，陽性反應(yīng)的zui大稀釋度為待測樣品的效價。 |
