人免疫球蛋白E（IgE）ELISA試劑盒說明書 檢測原理 試劑盒采用雙抗體一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）。往預(yù)先包被人胰島素（INS）捕獲抗體的包被微孔中，依次加入標(biāo)本、標(biāo)準(zhǔn)品、HRP標(biāo)記的檢測抗體，經(jīng)過溫育并*洗滌。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的人胰島素（INS）呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm 波長下測定吸光度（OD 值），計(jì)算樣品濃度。 樣品收集、處理及保存方法 1. 血清：使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管，操作過程中避免任何細(xì)胞刺激，收集血液后，3000轉(zhuǎn)離心10分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。 2. 血漿：EDTA、檸檬酸鹽或肝素抗凝。3000轉(zhuǎn)離心30分鐘取上清。 3. 細(xì)胞上清液：3000轉(zhuǎn)離心10分鐘去除顆粒和聚合物。 4. 組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。3000轉(zhuǎn)離心10分鐘取上清。 5. 保存：如果樣本收集后不及時(shí)檢測，請按一次用量分裝，凍存于-20℃，避免反復(fù)凍融，在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。 自備物品 酶標(biāo)儀（450nm）
高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL、20-200uL、200-1000uL
37℃恒溫箱 操作注意事項(xiàng) 試劑盒保存在2-8℃，使用前室溫平衡20分鐘。從冰箱取出的濃縮洗滌液會有結(jié)晶，這屬于正?，F(xiàn)象，水浴加熱使結(jié)晶*溶解后再使用。
實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回自封袋中，密封（低溫干燥）保存。
標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液即可視為陰性對照或者空白；預(yù)處理后的樣本無需稀釋，直接取10μL加樣即可。
嚴(yán)格按照說明書中標(biāo)明的時(shí)間、加液量及順序進(jìn)行溫育操作。
所有液體組分使用前充分搖勻。 試劑的準(zhǔn)備 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋，即1份的20×洗滌緩沖液加19份的蒸餾水。 洗板方法 手工洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，靜置1min后甩盡孔內(nèi)液體，在吸水紙上拍干，如此洗板5次。
自動洗板機(jī)：每孔注入洗液350μL，浸泡1min，洗板5次。 操作步驟 從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條，剩余板條用自封袋密封放回4℃。
設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔、樣本孔和空白孔，空白孔什么都不加；標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品50μL；
待測樣本孔各加待測樣本50μL；
隨后標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔中（空白孔不加）加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測抗體100μL，，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min。
棄去液體，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液，靜置1min，甩去洗滌液，吸水紙上拍干，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）。
所有孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
所有孔加入終止液50μL，15min內(nèi)，在450nm波長處測定各孔的OD值。 |
