【實(shí)驗(yàn)原理】 如圖所示，親和層析的高度選擇性使得從某一初始材料中純化，富集某一含量較低的目的蛋白成為可能，因此親和層析是蛋白質(zhì)分離純化過(guò)程中zui有效的方法之一。另外，如果配基與蛋白質(zhì)的親和能力很強(qiáng)，也可同時(shí)進(jìn)行樣品的濃縮。 雖然多數(shù)情況下不需要將抗體與其他血清蛋白分開(kāi)，但如果一旦需要，蛋白A親和層析是一種非常有效的分離方法。蛋白A是從Staphylococcus aureus中獲得，可與抗體重鏈的Fc片段相結(jié)合。現(xiàn)在已知蛋白A可與多種哺乳動(dòng)物的IgG相結(jié)合也可與某些IgM和IgA相結(jié)合。如果將蛋白A與固相載體相連，例如sepharose CL-4B，這種填料可以成為分離和純化不同類(lèi)型，不同亞類(lèi)抗體或抗體片斷的重要工具。 【實(shí)驗(yàn)材料】 ⒈.實(shí)驗(yàn)儀器 蛋白A柱（含10ml或5ml填料）；泵；離心管；離心機(jī)；pH試紙；過(guò)濾器；玻璃柱。 ⒉.實(shí)驗(yàn)試劑 ⑴ TBS緩沖溶液：6.06g Tris (50 mM), 8.78g NaCl (150mM)以及0.5g*(0.05%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH 7.4。 ⑵ 中和緩沖溶液：121.2g Tris (1 M), 87.8g NaCl(1.5 M), 0.37g EDTA (1mM)及5g*(0.5%)溶于1L蒸餾水中，并用HCl調(diào)節(jié)pH8.0。 ⑶ 洗脫緩沖溶液(pH2.7)：將3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH 2.7。 ⑷ 洗脫緩沖溶液(pH1.9)：將3.75g甘氨酸(50 mM)溶解于1L蒸餾水中，用HCl調(diào)節(jié)pH 1.9。 【實(shí)驗(yàn)方法】 1. 親和層析 將抗體用TBS緩沖溶液以1：5的比例進(jìn)行稀釋?zhuān)儆眠^(guò)濾器進(jìn)行過(guò)濾。以每分鐘0.5 ml的速度將抗血清上到柱上,為保證抗血清與填料的結(jié)合，需連續(xù)上柱2次并保留上樣流出液。用TBS緩沖溶液清洗柱子至Aλ280nm<0.008后加pH2.7洗脫緩沖溶液，以0.5ml/min的速度洗脫至所有蛋白均流下來(lái)。用已經(jīng)加入100ul中和緩沖溶液的1.5 ml EP管分管收集洗脫液，混勻后用pH試紙檢查洗脫液的pH，如果pH低于7可利用中和緩沖液調(diào)至約pH7.4以防止抗體的變性。 在柱中加入10ml，pH1.9洗脫緩沖溶液，按上述方法收集洗脫液至Aλ280nm<0.008。<> 利用分光光度計(jì)測(cè)定各管中蛋白質(zhì)的含量。若蛋白濃度低于0.5mg/ml可加入10%的甘油以便保存，將純化的抗體分裝后在2oC~8oC保存。 用含0.05%*的TBS緩沖溶液清洗柱子后將柱子儲(chǔ)存在2oC~8oC環(huán)境。 2. 準(zhǔn)備蛋白A sepharose CL-4B親和柱 通常準(zhǔn)備5ml或10 ml蛋白Asepharose CL-4B填料，在真空瓶中將等體積的填料和TBS緩沖溶液混合，攪拌。抽真空約15分鐘以除去填料中的氣泡，否側(cè)在柱中形成的氣泡影響柱子的容量和分離效果。將蛋白Asepharose CL-4B填料緩慢加入玻璃柱中，利用泵控制填充速度為1 ml/分-2 ml/分，避免柱干，利用10倍于床體積并經(jīng)過(guò)預(yù)冷的TBS緩沖溶液平衡柱子。 3. 制備抗血清 將抗血清放入冰水或4oC冰箱中緩慢解凍以避免蛋白質(zhì)的聚集。在蛋白質(zhì)解凍過(guò)程中出現(xiàn)的聚集可通過(guò)37oC預(yù)熱而溶解。抗體加入固體*至濃度為0.05%，4oC，15,000xg離心5分鐘，移出澄清的抗血清再經(jīng)過(guò)濾器過(guò)濾除去多余的脂。 【實(shí)驗(yàn)結(jié)果】 利用SDS/PAGE檢查洗脫獲得的蛋白純度并利用免疫電泳技術(shù)檢查純化后抗體的滴度。 【注意事項(xiàng)】 ⒈ *有毒，應(yīng)戴手套并小心操作 ⒉ 在純化過(guò)程中，預(yù)冷的TBS緩沖溶液可減少抗體蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合和微生物的代謝。 |
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