DIGE熒光差異蛋白表達分析系統(tǒng)在傳統(tǒng)雙向電泳技術(shù)的基礎(chǔ)上，結(jié)合了多重?zé)晒夥治龅姆椒?，在同一塊膠上共同分離多個分別由不同熒光標記的樣品，并*次引入了內(nèi)標的概念，極大地提高了結(jié)果的準確性，可靠性和重復(fù)性。在DIGE技術(shù)中，每個蛋白點都有它自己的內(nèi)標，并且軟件全自動根據(jù)每個蛋白點的內(nèi)標對其表達量進行校準，保證所檢測到的蛋白豐度變化是真實的。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學(xué)可信度達到95%以上。ELISA試劑盒 熒光染料種類雖多，但用于蛋白質(zhì)組樣品標記的熒光染料不同于普通熒光染料，標記后的蛋白質(zhì)不應(yīng)該有等電點上的改變，分子量上的改變也應(yīng)該保持zui小而且不同熒光染料導(dǎo)致的分子量的改變應(yīng)該一致。用于蛋白質(zhì)預(yù)先標記的熒光染料分為兩類，zui小標記和飽和標記。其中zui小標記熒光染料包括三種，分別是Cy2，Cy3和Cy5。這三種熒光染料化學(xué)結(jié)構(gòu)上相似，分子量接近，帶有相同的活化基團-NHS脂，可以特異性的標記在賴氨酸殘基的ε氨基上，由于三種染料均帶有一個正電荷，這樣通過取代反應(yīng)蛋白質(zhì)的等電點不會發(fā)生改變，保證了不同樣品中的相同蛋白質(zhì)可以泳動到相同的位置。不過要注意，過多的染料標記會導(dǎo)致蛋白質(zhì)的疏水性增加而不易溶解。保持1～2 %的蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基被熒光標記修飾，才可以維持被標記的蛋白在電泳時的溶解性，因此，在標記樣品時，保證合適的蛋白質(zhì)和染料的摩爾數(shù)比例至關(guān)重要。通過調(diào)整合適的pH值、合適的染料和蛋白質(zhì)的摩爾比，可以保證每個蛋白質(zhì)分子zui多只標記上一個染料分子，來保證蛋白質(zhì)的分子量變化zui小。ELISA試劑盒 一、主要特點： 1. DIGE熒光差異分析，用于檢測蛋白表達中真實的生物學(xué)差異，并對差異進行定量。 2. DIGE技術(shù)結(jié)合了蛋白質(zhì)組學(xué)研究中經(jīng)典的雙向電泳技術(shù)和*的多重?zé)晒夥治黾夹g(shù)。 3. 不同的樣品分別由電荷和分子量匹配的DIGE熒光標記物預(yù)標記，隨后再混合并在同一塊膠上跑電泳。 4. 常規(guī)檢測到小于10%的蛋白表達差異而統(tǒng)計學(xué)可信度達到95%。 二、實驗流程： 1. 為保證實驗順利進行，須對樣本進行預(yù)實驗，以檢測甲方提供的樣品是否合格。 2. 預(yù)實驗順利完成后，進行正式實驗，電泳前以Cy2、Cy3 和Cy5三種熒光染料分別標記蛋白質(zhì)樣品（其中包括一個蛋白質(zhì)內(nèi)標），將標記好的蛋白質(zhì)樣品混合，在同一塊膠上進行雙向電泳，電泳結(jié)果分別用3種不同的激發(fā)波長得到不同顏色的熒光信號，根據(jù)這些信號的比例來判定樣品之間蛋白質(zhì)的差異。DIGE技術(shù)可檢測到樣品間小于10%的蛋白表達差異，統(tǒng)計學(xué)可信度達到95%以上。 3. 質(zhì)譜分析（包括膠內(nèi)酶切、串聯(lián)質(zhì)譜分析和數(shù)據(jù)庫檢索） 4、蛋白點的質(zhì)譜鑒定：質(zhì)譜的數(shù)據(jù)通過MASCOT數(shù)據(jù)庫檢索來確定蛋白點所對應(yīng)的基因 三、主要應(yīng)用： 采用DIGE技術(shù)，通過對不同類型，不同個體的細胞、組織、或經(jīng)過不同處理和不同生長條件下蛋白質(zhì)表達差異分析，在研究疾病的分子機理、分子診斷、藥物作用機理、毒理學(xué)等方面都有廣泛的應(yīng)用。尤其是通過對各種疾病組織和正常組織進行比較，可以得到針對特定疾病（例如腫瘤）的一些標記蛋白質(zhì)，得到的這些蛋白質(zhì)可以用來作為疾病分子診斷的標記，或為進一步的疾病治療以及藥物開發(fā)提供有價值的信息。 DIGE是目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中可信度和準確率zui高的技術(shù)之一，是已經(jīng)經(jīng)過驗證并且被許多的蛋白質(zhì)組學(xué)研究部門肯定的技術(shù)。DIGE技術(shù)已經(jīng)在各種樣品中得到應(yīng)用，包括人、大鼠、小鼠、真菌、細菌等，主要用于蛋白質(zhì)組學(xué)，如各種腫瘤研究，尋找疾病分子標志物，揭示藥物作用的分子機制或毒理學(xué)研究等方面。ELISA試劑盒 |
