（一）細(xì)菌培養(yǎng)物的生長(zhǎng) 從瓊脂平板上挑取一個(gè)單菌落，接種到培養(yǎng)物中(有含有行當(dāng)抗生素的液體培養(yǎng)基中生長(zhǎng))，然后從中純化質(zhì)粒，質(zhì)粒的提純幾乎總是如此?，F(xiàn)在使用的許多質(zhì)粒載體（如pUC系列）都能復(fù)制到很高的拷貝數(shù)，惟致只要將培養(yǎng)物放在標(biāo)準(zhǔn)LB 培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到對(duì)數(shù)晚期，就可以大量提純質(zhì)粒。此時(shí)，不必造反性地?cái)U(kuò)增質(zhì)粒DNA。然而，較長(zhǎng)一代的載體(如pBR322)由于不能如此自由地復(fù)制，所以需要在得到部分生長(zhǎng)的細(xì)菌培養(yǎng)物中加入氯霉素繼續(xù)培養(yǎng)若干小時(shí)，以便對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行性擴(kuò)增。氯霉素可抑制宿主的蛋白質(zhì)合成，結(jié)果阻止了細(xì)菌染色體的復(fù)制，然而，松弛型質(zhì)粒仍可繼續(xù)復(fù)制，在若干小時(shí)內(nèi)，其拷貝數(shù)持續(xù)遞增。這樣，像pBR322－類的質(zhì)粒，從經(jīng)氯霉素處理和未經(jīng)處理的培養(yǎng)物中提取質(zhì)粒的產(chǎn)量迥然不同，前者大為增高。多年來(lái)，加入足以*抑制蛋白質(zhì)合成的氯霉素μg/ml)已成為標(biāo)準(zhǔn)的操作、用該方法提取的質(zhì)粒DNA量，對(duì)于分子克隆中幾乎所有想象到的工作任務(wù)。細(xì)胞 （二）細(xì)菌的收獲和裂解 細(xì)菌的收獲可通過(guò)離心來(lái)進(jìn)行，而細(xì)菌的裂解則可以采用多種方法中的任意一種，這些方法包括用非離子型或離子型去污劑、有機(jī)溶劑或堿進(jìn)行處理及用加熱處理等。選擇哪一種方法取決于3個(gè)因素：質(zhì)粒的大小、小腸桿菌菌株及裂解后用于純化質(zhì)粒DNA的技術(shù)。 盡管針對(duì)質(zhì)粒和宿主的每一種組合分別提出的裂解條件不切實(shí)際，但仍可據(jù)下述一般準(zhǔn)則來(lái)選擇適當(dāng)方法，以取得滿意的結(jié)果。 1)大質(zhì)粒(大于 15kb)容易受損，故應(yīng)采用漫和裂解法從細(xì)胞中釋放出來(lái)。將細(xì)菌懸于蔗糖等滲溶液中，然后用溶菌酶和EDTA進(jìn)生處理，破壞細(xì)胞壁和細(xì)胞外膜，再加入 SDS一類去污劑溶解球形體。這種方法zui大限度地減小了從具有正壓的細(xì)菌內(nèi)部把質(zhì)粒釋放出來(lái)所需要的作用力。 2)可用更劇烈的方法來(lái)分離小質(zhì)粒。在加入EDTA后，有時(shí)還在加入溶菌酶后讓細(xì)菌暴露于去污劑，通過(guò)煮沸或堿處理使之裂解。這些處理可破壞堿基配對(duì)，故可使宿主的線狀染色體DNA變性，但閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈由于處于拓?fù)淅p繞狀態(tài)而不能彼此分開。當(dāng)條件恢復(fù)正常時(shí)，質(zhì)粒DNA鏈迅速得到準(zhǔn)確配置，重新形成*天然的超螺旋分子。 3) 一些大腸桿菌菌株(如HB101的一些變種衍生株) 用去污劑或加熱裂解時(shí)可釋放相對(duì)大量的糖類，當(dāng)隨后用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心進(jìn)行質(zhì)粒純化時(shí)它們會(huì)惹出麻煩。糖類會(huì)在梯度中緊靠超螺旋質(zhì)粒DNA所占位置形成一致密的、模糊的區(qū)帶。因此很難避免質(zhì)粒DNA內(nèi)污染有糖類，而糖類可抑制多種限制酶的活性。 故從諸 如HB101和TG1等大腸桿菌蓖株中大量制備質(zhì)粒時(shí)，不宜使用煮沸法。 4)當(dāng)從表達(dá)內(nèi)切核酸酶A的大腸桿菌菌株(endA+株，如 HB101) 中小量制備質(zhì)粒時(shí)，建議不使用煮沸法。因?yàn)橹蠓胁荒?滅活內(nèi)切核酸酶A，以后在溫育(如用限制酶消化)時(shí)，質(zhì)粒DNA會(huì)被降解。但如果通過(guò)一個(gè)附加步驟 (用酚：進(jìn)行抽提)可以避免此問(wèn)題。 5)目前這一代質(zhì)粒的拷貝數(shù)都非常高，以致于不需要用氯霉素進(jìn)行選擇性擴(kuò)增就可獲得高產(chǎn)。然而，某些工作者沿用氯霉素并不是要增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，而是要降低細(xì)菌細(xì)胞在用于大量制備的溶液中所占體積。大量高度粘稠的濃縮細(xì)菌裂解物，處理起來(lái)煞為費(fèi)事，而在對(duì)數(shù)中期在增減物中加入氯霉素可以避免這種現(xiàn)象。有氯霉素存在時(shí)從較少量細(xì)胞獲得的質(zhì)粒DNA的量以與不加氯霉素時(shí)從較大量細(xì)胞所得到的質(zhì)粒DNA的量大致相等。 (三)質(zhì)粒DNA的純化 常使用的所有純化方法都利用了質(zhì)粒DNA 相對(duì)較小及共價(jià)閉合環(huán)狀這樣兩個(gè)性質(zhì)。例如，用氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心分離質(zhì)粒和染色體DNA 就取決于溴化乙錠與線狀以及與閉環(huán)DNA分子的結(jié)合量有所不同。 溴化乙錠通過(guò)嵌入奮不顧身堿基之間而與DNA結(jié)合，進(jìn)而使雙螺旋解旋。由此導(dǎo)致線狀DNA的長(zhǎng)度有所增加，作為補(bǔ)償，將在閉環(huán)質(zhì)粒DNA中引入超螺旋單位。zui后，超螺旋度大為增加， 從而阻止了溴化乙錠分了的繼續(xù)嵌入。但線狀分子不受此限，可繼續(xù)結(jié)合更多的染料，直至達(dá)到飽和( 每2個(gè)堿基對(duì)大約結(jié)合1個(gè)溴化乙錠分子) 。由于染料的結(jié)合量有所差別，線狀和閉環(huán)DNA分了在含有飽和量溴化乙錠的氯化銫度中的浮力密度也有所不同。多年來(lái)，氯化銫－溴化乙錠梯度平衡離心已成為制備大量質(zhì)粒DNA 的方法。然而該過(guò)程既昂貴又費(fèi)時(shí)，為此發(fā)展了許多替代方法。其中主要包括利用離子交換層析、凝膠過(guò)濾層析、分級(jí)沉淀等分離質(zhì)粒DNA和宿主DNA的方法。本實(shí)驗(yàn)室采用離子交換層析法已可得到*純度的質(zhì)粒 |
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