在構(gòu)建重組表達(dá)體系時(shí)，當(dāng)目的基因和載體重組并導(dǎo)人宿主后，并非能全部按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方式重組和表達(dá)，由于各種副反應(yīng)的存在、重組DNA導(dǎo)人宿主的低效率、操作的失誤及其他不可預(yù)測(cè)因素的干擾，真正獲得目的基因并能有效表達(dá)的重組子只是一小部分，而絕大部分仍是原來(lái)的受體細(xì)胞，或者是不舍目的基因的克隆。為了從處理后的大量受體細(xì)胞中分離出真正所需的重組子，需要采用一系列篩選和鑒定的方法。 1.耐藥性基因篩選法 篩選重組菌的具體方法因所采用的載體一宿主系統(tǒng)的不同而不同。很多細(xì)菌表達(dá)系統(tǒng)的載體一般帶有抗生素抗性篩選標(biāo)記，如四環(huán)素抗性基因(tetr)、氨芐西林抗性基因(ampr)、卡那霉素抗性基因(kanr)等。當(dāng)編碼有這些耐藥性基因的質(zhì)粒攜帶目的DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞后，便可使重組細(xì)胞在含這些抗生素的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。由于要篩選的是含目的DNA的重組菌，為了區(qū)分含重組質(zhì)粒的克隆和含空質(zhì)粒的克隆，可以采用插人失活檢測(cè)法。這種方法是將目的DNA插入到載體的某個(gè)抗性基因之中．使該抗性基因失活，這樣含重組質(zhì)粒的克隆便不能在含這一抗生素的培養(yǎng)基中存活，而含空質(zhì)粒的克隆則能存活。例如前面介紹的pBR322質(zhì)粒上有兩個(gè)抗生素抗性基因，抗氨芐西林基因(ampr)上有單一的Pst I位點(diǎn)，抗四環(huán)素基因(tetr)上有SalI和BamHI位點(diǎn)。當(dāng)外源DNA片段插入到SalI／Bam H I位點(diǎn)時(shí)，使抗四環(huán)素基因失活，這時(shí)含有重組體的菌株從amprtetr變?yōu)閍mp r tet s。這樣，凡是在含氨芐西林的平板上能生長(zhǎng)，而在同時(shí)含氨芐西林和四環(huán)素的平板上不能生長(zhǎng)的菌落就可能是所要的重組體。 利用耐藥性基因進(jìn)行篩選的另一方法是直接篩選法。由于在一種質(zhì)粒上往往具有兩種耐藥性基因，用插入失活檢測(cè)法時(shí)要在分別含兩種抗生素的平板上進(jìn)行篩選。為了做到在一個(gè)平板上直接篩選，可將插入缺失重組后轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞培養(yǎng)在含四環(huán)素和環(huán)絲氨酸的培養(yǎng)基中，重組體馴。生長(zhǎng)受到抑制，非重組體tet s雖能使細(xì)胞生長(zhǎng)，但因環(huán)絲氨酸可在蛋白質(zhì)合成時(shí)摻人而導(dǎo)致細(xì)胞死亡。重組體tet s因僅僅是受抑制，故接種到另一培養(yǎng)基中時(shí)便可重新生長(zhǎng)。 2. a-互補(bǔ)法 這是目前經(jīng)常使用的重組子篩選方法。許多載體都帶有一個(gè)大腸桿菌爭(zhēng)半乳糖苷酶基因(lacz)的調(diào)控序列和前146個(gè)氨基酸等蛋白質(zhì)N端部分序列。在這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)(MCS)。它并不破壞β-半乳糖苷酶N端的功能。在一些大腸桿菌宿主菌中，染色體上含有編碼口一半乳糖苷酶C端部分序列的基因，可以表達(dá)出口一半乳糖苷酶的C端蛋白質(zhì)。當(dāng)宿主和質(zhì)粒上的lacZ基因片段單獨(dú)存在時(shí)，分別表達(dá)出的蛋白質(zhì)產(chǎn)物不具有 β-半乳糖苷酶活性。但它們同時(shí)存在時(shí)，這些蛋白質(zhì)司表現(xiàn)出酶活性，買現(xiàn)J宿王細(xì)胞和質(zhì)粒上分別攜帶的lacZ基岡片段的功能互補(bǔ)，稱為a一互補(bǔ)。由a一互補(bǔ)而產(chǎn)生的大腸桿菌細(xì)胞在誘導(dǎo)劑IPTG的作用下，β-半乳糖苷酶催化X—gal變?yōu)樗{(lán)色，從而產(chǎn)生藍(lán)色菌落，因而易于識(shí)別。然而，當(dāng)外源DNA插入到質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)后，破壞了質(zhì)粒上的lacZ基因片段，不能表達(dá)出正確的N端蛋白質(zhì)，從而不能進(jìn)行a一互補(bǔ)，使得帶有重組質(zhì)粒的細(xì)菌形成白色菌落。因此，這種重組子的篩選，又稱為藍(lán)白斑篩選。 3.營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選法 還有一些表達(dá)體系采用的是營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選標(biāo)記，如一些酵母表達(dá)體系等。這樣的體系中，宿主細(xì)胞為營(yíng)養(yǎng)缺陷型，不能在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，而載體含有該缺陷型所缺失的基因．因此重組子可以在基本培養(yǎng)基上生長(zhǎng)。這樣，采用基本培養(yǎng)基就可起到選擇的效果。 通過(guò)上述方法篩選后，可以排除大量的未經(jīng)重組的宿主細(xì)胞。但是，這還不能保證剩余的細(xì)胞中目的基因全部按照預(yù)先設(shè)計(jì)的方式重組和表達(dá)。因此，zui后還需要通過(guò)直接檢測(cè)表達(dá)產(chǎn)物的方法加以鑒定。如果目的基因的編碼產(chǎn)物是酶，可以通過(guò)測(cè)定酶活力定量地確定表達(dá)水平。如果基因的編碼產(chǎn)物不具有已知的催化活性，則可采用蛋白質(zhì)電泳、酶聯(lián)免疫等方法定性、定量地測(cè)定表達(dá)產(chǎn)物。 |
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