(一)常用細胞轉(zhuǎn)化實驗 常用人工誘發(fā)細胞轉(zhuǎn)化實驗包括物理、化學和病毒誘導三種，下面介紹化學致癌物和病毒細胞轉(zhuǎn)化兩個實驗。 l.化學致癌物誘導細胞轉(zhuǎn)化實驗 (1)原理：化學致癌作用(chemical carcinogenesis)是指化學物質(zhì)引起或誘導正常細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化并發(fā)展成腫瘤的過程。通過細胞表型的改變，反映各種理化因素的致癌性，同時，可模擬化學致癌物在體內(nèi)致癌的過程，并可對發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞做直接觀察和各種分析。其中以敘利亞地鼠胚胎初代培養(yǎng)細胞較為常用，現(xiàn)在以N一甲基一N'一硝基一N一亞硝基胍(MNNG)進行細胞轉(zhuǎn)化實驗為例。 (2)材料 1)動物：鼠(如：敘利亞地鼠，金倉鼠等)。 2)細胞生長液：含20％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養(yǎng)液。 3)維持液：含5％小牛血清的RPMI 1640或MEM培養(yǎng)液。 4)消化液：O．25％胰蛋白酶(含O．01％EDTA)。 5)凍存液：含lO％小牛血清的DMSO。 6)致癌劑：MNNG。 7)洗液：PBS。 (3)方法 1)取材：妊娠第13天鼠，取數(shù)個同窩胚胎，去頭和內(nèi)臟，在無菌條件下剪碎至米粒大小，再用0．25％胰蛋白酶(含O．Ol％EDTA)37℃消化30min，濾過，低速離心，吸除消化液，加入營養(yǎng)液制備成細胞懸液，接種人75cm培養(yǎng)瓶中，接種密度為10～20×106／75 cm，37℃培養(yǎng)2～3d。 2)貯存：選大批生長狀態(tài)良好的細胞凍存。 3)致癌物處理：取凍存細胞，解凍后接種于25ml培養(yǎng)瓶中，每瓶含細胞10萬～30萬。待細胞生長進入指數(shù)增生期時，加入含0．5～1．Omg／L MNNG的*培養(yǎng)基，在37℃孵箱中培養(yǎng)12～48h。 4)低血清培養(yǎng)：棄掉MNNG致突變劑，用溫PBS洗2～3次，加入含20％小牛血清，繼續(xù)置溫箱中培養(yǎng)2～3周，然后改用含5％血清培養(yǎng)液培養(yǎng)。低血清培養(yǎng)液不利于正常細胞牛長，但已轉(zhuǎn)化的細胞仍能增殖和形成轉(zhuǎn)化灶。 5)轉(zhuǎn)化灶的形成：用致癌物處理過的細胞于10d后在正常細胞之間，可產(chǎn)生數(shù)量不等的轉(zhuǎn)化灶。轉(zhuǎn)化灶由密集而重疊的細胞組成。在透光檢查時，肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉(zhuǎn)化灶。顯微鏡下觀察，未轉(zhuǎn)化的成纖維細胞轉(zhuǎn)化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性，失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶邊緣，轉(zhuǎn)化細胞與正常細胞界限分明，形態(tài)區(qū)別相當明顯。上皮細胞轉(zhuǎn)化后形態(tài)變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。 6)轉(zhuǎn)化細胞的分離：將培養(yǎng)瓶放在倒置顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)化細胞，將轉(zhuǎn)化灶用記號筆標記。用細胞刮去除未發(fā)生轉(zhuǎn)化的外圈正常細胞。向瓶內(nèi)加入PBS清洗3次，再加入消化液．37℃下消化數(shù)分鐘。鏡下觀察細胞變圓時，加人含10%小牛血清的*培養(yǎng)液，反復用吸管吹打分散，制成細胞懸液，分瓶培養(yǎng)。成單層后，再用傳代法擴大培養(yǎng)。 (4)轉(zhuǎn)化細胞觀察與鑒定：轉(zhuǎn)化灶由密集而重疊的細胞組成。肉眼可見有大小不等的白色斑塊轉(zhuǎn)化灶。顯微鏡下觀察，成纖維細胞轉(zhuǎn)化后，胞體增大，成多邊形，生長無方向性．失去接觸抑制，向三維空間延伸排列，細胞相互重疊。在轉(zhuǎn)化灶邊緣，轉(zhuǎn)化細胞與正常細胞界限分明，形態(tài)區(qū)別明顯。上皮細胞轉(zhuǎn)化后形態(tài)變化不如成纖維細胞差別大，需仔細識別。 2．病毒轉(zhuǎn)化細胞實驗 (1)原理：很多病毒都有轉(zhuǎn)化細胞的作用，尤以致癌病毒zui為明顯。EB病毒(EBV)是近年來常用于轉(zhuǎn)化細胞的病毒。該病毒對人二倍體細胞的轉(zhuǎn)化效果，常用于建立淋巴細胞永生細胞系。人外周血B淋巴細胞膜上有。EB病毒受體，當EB病毒與受體結(jié)合后，B淋巴細胞可發(fā)生轉(zhuǎn)化，成為體外長期傳代生長的細胞系。 (2)材料 1)病毒：EB病毒液(取自培養(yǎng)的B95—8細胞)。 2)轉(zhuǎn)化細胞：檸檬酸或肝素抗凝人外周血。 3)細胞培養(yǎng)液：含20％胎牛血清的RPMI 1640。 4)抗生素：青霉素、鏈霉素和慶大霉素。 5)洗液：PBS。 (3)方法 1)血液制備：抗凝全血1～2ml，分裝于15ml離心管中，每管O．5ml，置于4℃冰箱中放置30min后，加入不含血清的RPMI1640離心洗一次，用含20％胎牛血清的細胞培養(yǎng)液制成細胞懸液。 2)EB病毒的獲得：培養(yǎng)的B95—8細胞，10000r／min離心15min去除細胞碎片，再經(jīng)24000r／min，離心90min獲得病毒沉淀，以1：100體積培養(yǎng)液溶解獲得EB病毒濃縮液。 3)EB病毒轉(zhuǎn)化：加入EB病毒液，O．3～0．5ml／管，37℃水浴30min～2h，并不時搖動，以利于病毒吸附和并防止血凝塊產(chǎn)生。 4)分裝入50ml培養(yǎng)瓶中，同時補加培養(yǎng)液，5ml／管，置入含5％CO2的37℃溫箱中培養(yǎng)。 5)細胞培養(yǎng)一周后再補入2ml培養(yǎng)基。 6)每3～4d加液或半量換液，隨細胞數(shù)量增多，可分裝人大瓶中培養(yǎng)。為了提高轉(zhuǎn)化效率，常將全血凍存復蘇后采用。 (4)結(jié)果觀察與鑒定：需每天鏡檢培養(yǎng)物，開始培養(yǎng)時，鏡下可見大量紅細胞，難以觀察到單核細胞。培養(yǎng)5～7d后，單個或成團的淋巴細胞增殖迅速，成大團塊，呈懸浮生長，紅細胞已*消失，轉(zhuǎn)化完成。 |
