(一)原理 染色體顯帶是沿著整個(gè)染色體的長軸，能顯現(xiàn)出著色深淺不同、橫向走行的帶。顯帶原理尚未*弄清，從多種方法證實(shí)，染色體顯帶現(xiàn)象是染色體本身存在著帶的結(jié)構(gòu)。因用相差顯微鏡觀察未染色的染色體時(shí)，也能直接觀察到染色體存在著帶的現(xiàn)象。但用特殊方法處理后，再用染料染色，則帶更加清楚。隨顯帶方法不同，顯H{來的帶的特點(diǎn)也不一樣，說明帶的出現(xiàn)又與染料特異結(jié)合有關(guān)。一般認(rèn)為，易著色的陽性帶(positive band)為含有A—T多的染色體節(jié)段；相反，G—C多的則不易著色，為陰性帶(negative band)。有報(bào)道已被定位的正?；蚝彤惓；蚪^大部分都在陰性帶區(qū)。根據(jù)推測(cè)，管家基因(house keeping gene)可能多在陽性區(qū)帶，組織特異基因在陰性區(qū)帶。ELISA試劑盒 (二)染色體顯帶方法要點(diǎn) 1．分帶種類 根據(jù)所用顯帶方法不同，可分為： (1)Q帶：用奎吖因(quinacrl’ne mlastard：QM)和阿的平(atebrim quinacrlne dhy—drochloride：QD)熒光染色的帶，稱“Q”帶。 (2)G帶：用Glemsa染色顯帶稱“G”帶。 (3)C帶：用Giemsa染色顯示異染色質(zhì)部分稱“C”帶。 (4)R帶：用特殊方法處理后，顯現(xiàn)出與Q帶和G帶相反的帶型稱“R”帶等。 目前已顯現(xiàn)出很多種帶型，如Q、G和c等帶，其中G帶更為多用。 2．中期染色體為獲得滿意的顯帶效果，首先需要制備出好的中期染色體標(biāo)本。染色體質(zhì)量好的標(biāo)準(zhǔn)是：①長度適宜，一般要稍長一些，能顯出更多的帶來；為此需嚴(yán)格控制秋木仙素的濃度、作用時(shí)間；濃度過大或作用時(shí)間過長，會(huì)使染色體短縮，對(duì)顯帶不利。②染色體分散均勻無重疊現(xiàn)象，此與低滲有密切關(guān)系；低滲不足染色體易發(fā)生重疊，低滲過度染色體易流失，故須恰到好處。③無嚴(yán)重單體分叉。 3．特殊處理中期染色體標(biāo)本制成后，立即顯帶時(shí)效果往往不理想。一般要經(jīng)過三個(gè)步驟：①先放置一段時(shí)間即所謂“老化”，老化時(shí)間以3~10d為宜。②在顯帶染色之前，對(duì)染色體標(biāo)本能進(jìn)行預(yù)處理，常用的辦法是加溫，利于顯出帶來；標(biāo)本做預(yù)處理后可不必再老化。③用胰蛋白酶消化、NaOH、尿素、無機(jī)鹽等化學(xué)試劑處理，其中以胰蛋白酶消化較好。ELISA試劑盒 (三)常用染色體顯帶方法 1．顯Q帶方法 (1)材料：中期染色體標(biāo)本。 (2)器具及試劑：熒光顯微鏡、吸管、蓋玻片、鑷子；磷酸緩沖液(pH5．5～6．O)。 (3)方法： 1)漂洗：取經(jīng)過干熱預(yù)處理或已老化的染色體標(biāo)本，置入pH 6．0緩沖液中浸5~10min。 2)染色：浸入pH 6．0的GM或QD染液中5~10min。 3)漂洗：浸入新鮮pH6．0緩沖液中漂洗2次，每次5min。 4)觀察：向標(biāo)本染色體面滴1～2滴新鮮緩沖液，覆以蓋玻片(避免出氣泡)，置熒光顯微鏡下觀察。 (4)注意事項(xiàng)：觀察期間，要隨時(shí)滴加緩沖液，以防蒸發(fā)干涸后熒光減弱；染色后標(biāo)本應(yīng)充分漂洗，避免殘留熒光染液，否則背底將發(fā)熒光影響觀察，標(biāo)本如因染色不足發(fā)光較弱，可揭去蓋玻片重染。 2．顯G帶方法 (1)胰酶一Giemsa混合顯帶法：是常用的顯帶方法，有操作簡便、經(jīng)濟(jì)和能長期保存的優(yōu)點(diǎn)。有關(guān)G帶顯示法在文獻(xiàn)中報(bào)道極多，但不一定都能重復(fù)出滿意的效果，可能與各研究室所用材料條件有關(guān)，因此引進(jìn)任何一顯帶法之前，還要進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)。 1)試劑：中期染色體標(biāo)本、0．025mol／L磷酸緩沖液(稱3．4克KH2P04，溶于1000ml蒸餾水中，用NaOH調(diào)到pH 6．8)甲醇、Giemsa染液、胰蛋白酶。 2)方法 ①預(yù)處理：取中期染色體標(biāo)本，置60～80℃溫箱中20～30min，或在37℃溫箱過夜；然后浸入0．025mol／L磷酸緩沖液中，pH6．8，56℃溫浴10min。 ②消化和染色：用現(xiàn)配的胰蛋白酶一Giemsa混合液消化和染色10~30min，混合液按如下比例配制： 0．025 mol／L磷酸緩沖液pH6．8 73．0ml 甲醇 27．0ml Giemsa干粉 50．0mg 0．25％胰酶 0．3～O．4ml ③封片：染色后用自來水沖洗(流水沖洗標(biāo)本背面)，人蒸餾水漂洗數(shù)次、晾干、二甲苯透明2~3min、封人中性樹脂中。 (2)Giemsa顯帶法 1)預(yù)處理：將標(biāo)本置入60℃~80℃溫箱或烤箱中20~30min；亦可在37％溫箱中過夜。 2)胰酶消化：用0．85％的NaCl配制0．25％胰蛋白酶溶液(微孔濾膜無菌濾過)消化3~5min(用滴加在標(biāo)本上或用染色缸消化均可)。 3)染色：取出標(biāo)本片，先直立于吸水紙上除去多余胰酶液后，隨即置人Giemsa染液中．染10min。 4)封片：自來水洗、蒸餾水漂洗、晾干、二甲苯透明2～3min、封人中性樹膠中。 (3)注意事項(xiàng)：胰酶消化顯帶過程中，胰酶消化是重要的環(huán)節(jié)，消化不足帶不出現(xiàn)，消化過度，染色體變得膨脹和不著色，必須把握好胰酶濃度和消化持續(xù)時(shí)問。預(yù)處理或老化是顯帶過程中另一個(gè)重要環(huán)節(jié)，對(duì)消化和染色有很大影響，其中干熱處理是較簡便易行和效果好的辦法。ELISA試劑盒 |
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