目前大量關(guān)于腎的毒理學(xué)、藥物測(cè)試等研究需要腎小管上皮細(xì)胞株。但是，細(xì)胞株部分基因的變異或缺失與正常細(xì)胞存在差異，原代細(xì)胞在表達(dá)正常細(xì)胞生理狀態(tài)下則更顯優(yōu)勢(shì)[1],因此尋求一種有效的腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)尤為重要。 1 材料與方法 1.1 材料 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SD 大鼠，雄性，4~5 周齡；昆明小鼠，4~5 周齡。 1.2 主要試劑胎 牛 血 清（杭 州 四 季 青），DMEM-F12 1:1 培 養(yǎng) 基（Thermo），Ⅰ型膠原酶 （ 美國(guó) Sigma），胰酶消化液，雙抗（青霉素 - 鏈霉素溶液 100×），兔抗人角蛋白 CK18（Bioss），SABC免疫組化染色試劑盒，DAB 顯色試劑盒。 1.3 試驗(yàn)方法 1.3.1 腎小管節(jié)段分離 大鼠和小鼠實(shí)驗(yàn)前均禁食 12 小時(shí)，進(jìn)水自由。脫臼處死，75% 乙醇中浸泡 5min.在超凈臺(tái)中取出腎，置于冷的含雙抗的 PBS 溶液中，去除腎蒂和包膜，將腎皮質(zhì)剪碎大小至1mm3,PBS 洗滌 3 次后，放置 80 目不銹鋼篩網(wǎng)上，用 50ml滅菌注射器柄輕輕研磨，PBS 液充分清洗后的網(wǎng)下液轉(zhuǎn)移至100 目不銹鋼篩網(wǎng)中，將 100 目篩網(wǎng)倒置 PBS 沖洗取網(wǎng)上液。 取得的液體經(jīng) 1500r/min 離心 8min,棄去上清液在沉淀中加入Ⅰ型膠原酶，分別 37℃振蕩消化，振蕩消化時(shí)間分三組，分別為 20min,25min,30min.雙倍體積 DMEM-F12 培養(yǎng)基中和后，1500r/min 離心 8min. 1.3.2 腎小管上皮細(xì)胞的原代培養(yǎng)及傳代 在 上 述 離 心 后 的 沉 淀 中 加 入 含 10% 胎 牛 血 清 的DMEM-F12 培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻。接種到 25mL 培養(yǎng)瓶中。培養(yǎng)瓶靜置于 37℃ 5% 的 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h 后補(bǔ)加培養(yǎng)基。72h 后換液。之后隔天換液。原代培養(yǎng) 4~6 天，細(xì)胞貼滿瓶底，用胰蛋白酶消化并傳代培養(yǎng)。 1.3.3 換液后廢液的有效利用 72h 換液時(shí)，將廢液至于新的培養(yǎng)瓶中，添加適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基，靜置于 37℃ 5% 的 CO2 培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。視細(xì)胞貼壁狀態(tài)可于 48h 半換液，72h 全換液。 1.3.4 腎小管上皮細(xì)胞的鑒定1.3.4.1 倒置顯微鏡下對(duì)細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)進(jìn)行觀察1.3.4.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法（SABC 法）細(xì)胞爬片后，PBS 輕輕沖洗。4% 多聚甲醛固定 60min. 吸去多聚甲醛后空氣干燥 5min,加入 30%H2O2純甲醇（1:50）混合液浸泡 30min,滅活內(nèi)源性過氧化物酶，PBS 沖洗；加 5%BSA 封閉液，室溫條件 20min,吸去多余液體；加兔抗人角蛋白 CK18（1:200），PBS 作為陰性對(duì)照。37℃下孵育 1h,PBS 洗滌 3 次。加入生物素化山羊抗兔 IgG（博士德生物）室溫 20min,PBS 洗滌 3 次，加 SABC 37℃反應(yīng) 20min,洗片，使用 DAB 試劑盒（AR1002）顯色，蘇木素輕度復(fù)染，中性樹膠封片。 2 結(jié)果 2.1 SD 大鼠和昆明小鼠腎小管上皮細(xì)胞分離生長(zhǎng)和傳代的比較 SD 大鼠剛分離的以腎小管節(jié)段以及單個(gè)游離腎小管上皮細(xì)胞，在倒置顯微鏡下圓形透亮，體積較大，強(qiáng)折光性好。12h 后部分細(xì)胞開始貼壁，以腎小管節(jié)段周圍聚集密集。24h 后細(xì)胞大量貼壁且有少量上皮樣細(xì)胞爬出，72h 細(xì)胞緊密銜接呈典型鵝卵石鋪路樣，折光性好。SD 大鼠傳代至第二代時(shí)開始有細(xì)胞漂浮，傳代到第三代時(shí)大量凋亡。昆明小鼠剛分離的腎小管以腎小管節(jié)段居多，形態(tài)與大鼠相似。貼壁速度比 SD 大鼠略慢，但生長(zhǎng)速度快，培養(yǎng) 72h 已長(zhǎng)滿瓶底。傳代至第三代時(shí)依舊有大量細(xì)胞緊貼瓶底。 |
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